Beclin1基因研究論文
Beclin1基因也稱BECN1基因，是一種自噬相關(guān)基因，它與Bcl-2基因相互拮抗調(diào)控自噬。自噬是細胞中初級溶酶體處理內(nèi)源性底物的重要過程，同時參與維持細胞內(nèi)蛋白代謝平衡及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的維持，在清除廢物、結(jié)構(gòu)重建以及細胞生長發(fā)育中起重要作用。近來Ⅱ型程序性細胞死亡-自噬性細胞死亡研究迅速受到人們的關(guān)注。自噬曾被Science評為全球科技領(lǐng)域6個研究熱點之一。然而自噬性細胞死亡研究主要集中在腫瘤學(xué)領(lǐng)域，在寄生蟲學(xué)領(lǐng)域還很少得以開展，目前已有關(guān)于自噬在弓形蟲感染致病中的作用的研究報道，其中一種觀點認為細胞自噬通過降解作能清除進入胞內(nèi)的弓形蟲保護正常細胞不被感染，另一種觀點認為自噬參與弓形蟲感染復(fù)制過程，抑制了宿主細胞自噬就抑制了弓形蟲的增殖。然而關(guān)于細胞自噬在弓形蟲感染致病過程中的具體作用，自噬途徑能否成為抗弓形蟲治療的新靶點等還有待于深入研究。
本研究擬構(gòu)建Beclin1基因的真核表達載體并通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將外源性Beclin1基因?qū)?93T細胞，再以Western blot的方法驗證其在真核細胞內(nèi)的表達，為進一步探索外源性Beclin1基因?qū)蜗x生長、增殖及新的致病機制等提供基礎(chǔ)資料。
材料與方法
1.材料
1.1 細胞和載體
293T細胞和真核表達載體pEGFP均由安徽醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室保存。
1.2 主要試劑及儀器
質(zhì)粒小量提取試劑盒為美國Axygen公司產(chǎn)品，Trizol試劑和Lipo2000為美國Invitrogen公司產(chǎn)品;BamHⅠ、EcoRⅠ和rTaq mix為日本TaKaRa公司產(chǎn)品;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國Fermentas公司產(chǎn)品;DNA 膠回收試劑盒為德國QIAGEN公司產(chǎn)品;鼠抗pEGFP為英國Abcam 公司產(chǎn)品;HRP標記山羊抗鼠IgG為北京全式金公司產(chǎn)品。
2.方法
2.1 RT-PCR擴增目的基因
根據(jù)Trizol試劑說明書提取293T細胞的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA 為模板，以beclin1基因編碼區(qū)全長擴增引物Beclin1-F(5′-CGGAATTCTATGGAAGGGTCTAAGACGTCC-3′)和Beclin1-R (5′-CGGGATCCTCATTTGTTATAAAATTGTGAGGACA-3′)，進行PCR 反應(yīng)。取PCR產(chǎn)物5μl，用含EB的1%瓊脂糖凝膠進行電泳，分析PCR擴增結(jié)果，按DNA膠回收試劑盒的說明進行目的片段的回收和純化。
2.2 PCR 產(chǎn)物和載體pEGFP的酶切及純化
取PCR產(chǎn)物10μl，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切反應(yīng)，根據(jù)DNA 膠回收試劑盒說明進行酶切片段的回收和純化。
2.3 Beclin1基因與pEGFP的重組與鑒定
將雙酶切后膠回收的Beclin1和pEGFP按摩爾比3～10︰1的比例用1μl T4連接酶于16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α并進行培養(yǎng)，從培養(yǎng)12h～16h的卡那抗性培養(yǎng)平板上挑取若干單克隆，分別放入3ml含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃以200r/min振搖過夜，按照質(zhì)粒提取試劑盒說明提取質(zhì)粒。采用雙內(nèi)切酶切法和PCR法鑒定重組基因，雙酶切、PCR鑒定正確的重組表達質(zhì)粒送上海生工公司測序，并進行Blast比對分析。
2.4 Beclin1基因在真核細胞內(nèi)的表達
通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法分別將空載體pEGFP和pEGFP-Beclin1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細胞內(nèi)，24h后用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況，提取轉(zhuǎn)染后細胞總蛋白，采用Westernblot檢測Beclin1基因編碼蛋白的表達情況。
結(jié) 果
1 目的基因Beclin1PCR擴增提取293T 細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，用Beclin1基因全長擴增引物Primer-F和Primer-R擴增得到Beclin1基因全長編碼區(qū)片段，大小為1 353bp，與預(yù)期值一致。
2 pEGFP-Beclin1重組載體pEGFP-Beclin1的鑒定pEGFP-Beclin1經(jīng)過限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切得到1 353bp目的基因片段和約4 700bp的載體pEGFP片段，經(jīng)上海生物工程試劑公司測序，測序結(jié)果經(jīng)Blast比對與beclin1基因序列同源性為100%。
3 Beclin1蛋白在真核細胞內(nèi)的表達用LiPo 2000分別介導(dǎo)pEGFP和pEGFP-Beclin1轉(zhuǎn)染293T細胞，24h后在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光;Western blot檢測出目的`蛋白，大小與預(yù)測一致。
討 論
弓形蟲病是由專性細胞內(nèi)寄生的弓形蟲引起的人獸共患寄生蟲病，在世界各地普遍流行。患弓形蟲病的孕婦可能將弓形蟲傳染給胎兒，尤其當(dāng)感染發(fā)生在妊娠頭3個月，可引起流產(chǎn)，甚至死胎，或生下發(fā)育缺陷的患兒，已被列為感染性致畸(TORCH)綜合征主要原因之一。對于免疫功能嚴重損害或抑制者，弓形蟲同樣是引起致死性病變的主要病原體之一。近年來隨著人們生活水平的提高，飲食習(xí)慣的改變，食物來源的多樣化，飼養(yǎng)寵物的人數(shù)的增多，弓形蟲感染呈上升趨勢。傳統(tǒng)的抗弓形蟲藥物包括乙胺嘧啶、磺胺嘧啶等毒副作用較大，用藥時間長，只能殺死速殖子，停藥后易復(fù)發(fā)，因而限制了其應(yīng)用，至今仍缺少理想的治療弓形蟲病藥物。
近年來，細胞自噬成為研究的熱點，Beclin1基因作為自噬相關(guān)基因倍受青睞。本實驗構(gòu)建了pEGFP-Beclin1重組載體并檢測到該基因編碼的蛋白在真核細胞內(nèi)表達，為深入探索beclin1基因在弓形蟲感染致病作用中的影響，了解弓形蟲新的致病機制以及弓形蟲病的預(yù)防和治療打下了基礎(chǔ)。
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