p53基因在翼狀胬肉組織中表達的研究論文
【摘要】 目的 通過觀察p53基因在翼狀胬肉組織中的表達，探討翼狀胬肉的發病與凋亡機制之間的關系。方法 選擇25例翼狀胬肉組織作為實驗組，對照組選用正常眼鼻側結膜組織，制作石蠟切片后常規HE染色和p53單克隆抗體免疫組化染色，實驗數據進行秩和檢驗。結果 實驗組中的p53蛋白含量顯著高于對照組，兩者差異有高度顯著性(P<0.01)。結論 翼狀胬肉病變發展的早期可能存在著p53基因的突變，從而使正常p53腫瘤抑制基因作用喪失，導致結膜組織過度增殖及胬肉纖維血管組織向角膜的侵襲。
【關鍵詞】 翼狀胬肉 基因 p53 免疫組織化學
翼狀胬肉是一種臨床上常見的眼表疾病，它以結膜下纖維血管組織呈三角形增生并向角膜侵犯為特征，多見于鼻側瞼裂區，常雙眼發病，術后易復發。發展到一定程度可引起散光、視力下降、眼部不適感及美容問題，影響患者的身心健康［1］。關于翼狀胬肉的病因和發病機制仍未明確，目前認為日光中的紫外線是最重要的環境致病因素。在紫外線氧化應激引起的DNA損傷中，p53基因是最常見的被損傷的基因之一［2］。本研究通過觀察p53基因在翼狀胬肉組織中的表達，探討翼狀胬肉的發病與凋亡機制之間的關系，為明確翼狀胬肉的病因和發病機制奠定基礎。
1 資料與方法
1.1 一般資料
25例翼狀胬肉組織標本(實驗組)隨機取自中山市南朗醫院眼科病人，均為原發性翼狀胬肉患者，胬肉位于鼻側。其中男10例，女15例，年齡為47～76歲，平均53.9歲。5例對照組為正常眼鼻側結膜組織，年齡為51～62歲，平均55.8歲。所有病例均無其他角膜、結膜疾病。各組在年齡、性別、病程方面經統計學處理差異無顯著性(P>0.05)，具有可比性。選取胬肉頭頸部組織，包括表面結膜樣組織，對照組選自正常眼鼻側結膜組織，距角膜緣約1～2mm，組織大小約3～4mm。取材后即置入10%的甲醛溶液浸泡固定，常規脫水、石蠟包埋。
1.2 石蠟切片的制作
從10%甲醛溶液中取出組織，流水沖洗過夜，依次采用乙醇梯度脫水，70%乙醇15s，80%、90%、95%、100%乙醇各3h，二甲苯透明3次，每次10min，從低熔點石蠟到高熔點石蠟浸蠟，共3次，每次1h。包埋，4μm連續切片，每個石蠟塊切4～5張。
1.3 HE染色
將組織切片依次放入二甲苯脫蠟和95%乙醇各2次，每次1min；蒸餾水沖洗2次，每次5min；蘇木精染色液浸染10min；流水沖洗5min；0.5%伊紅乙醇浸染2min；95%乙醇和無水乙醇脫水各2次，每次2min；滴中性樹脂，加蓋玻片，光鏡下觀察翼狀胬肉組織的病理學改變。
1.4 免疫組化染色
切片脫蠟至水化，櫞酸微波抗原修復15min，3%H2O2室溫孵育10min，以消除內源性過氧化物酶活性。PBS浸泡3×5min，加入即用型鼠抗人p53單克隆抗體，4℃過夜，PBS沖洗3×5min，滴加生物素標記的二抗，室溫孵育30min，PBS沖洗3×5min，每張切片滴加約50μl抗生物素-過氧化酶溶液，室溫30min。PBS沖洗3×3min。滴加新鮮配制的DAB溶液顯色3～10min。用自來水沖洗，蘇木素復染，中性樹膠封固。以PBS替代一抗作為陰性對照。陽性對照片由福州邁新公司提供。
1.5 結果判斷標準
以細胞漿內出現棕色或棕黃色顆粒為陽性染色，每張切片在高倍顯微鏡下(200倍)隨機選擇5個視野，計算每個視野陽性細胞率，取平均值作為該標本的陽性細胞率。根據陽性細胞數占上皮細胞的'比例判斷結果：0～5%為陰性 （-），5%～25%為弱陽性（+），25%～50%為中等陽性（++），＞50%為強陽性（+++）。
1.6 統計學處理
采用SPSS 11.0軟件，將實驗組與對照組的實驗數據進行秩和檢驗。
2 結果
2.1 HE染色
2.1.1 正常結膜的組織學表現
結膜分為上皮層和基質層。上皮層由3～5層細胞組成，表層為扁平細胞，中層為多邊形細胞，基底層為立方形或柱形細胞。基質層為疏松結締組織，其間有散在的毛細血管，少量成纖維細胞、淋巴細胞和中性粒細胞。
2.1.2 翼狀胬肉組織的病理學表現
胬肉組織上皮層均可見不同程度的增生。上皮下組織可見成纖維細胞增生活躍、新生血管增多，在血管周圍有大量炎性細胞浸潤，有淋巴細胞、漿細胞和少量的中性粒細胞。
2.2 免疫組化染色
在翼狀胬肉中，p53蛋白染色陽性細胞主要位于上皮細胞基底層。p53基因蛋白產物陽性反應呈棕黃色顆粒，在細胞核呈陽性表達。p53蛋白在兩組中的表達見表1，翼狀胬肉中的p53蛋白含量較正常結膜高，兩者差異具有高度顯著性(P<0.01)。表1 p53蛋白在翼狀胬肉和正常結膜樣本中的表達（略）
3 討論
翼狀胬肉是一種組織增生性疾病，以新生的纖維血管組織自球結膜生長向角膜表面侵襲為其特點。目前，關于翼狀胬肉的病因和發病機制仍未明確。翼狀胬肉的臨床表現為新生的組織不斷生長、增厚，并逐漸侵入角膜，手術切除后易復發，治療效果不甚理想［3］。此特點與腫瘤組織相似，腫瘤發生發展的重要原因是細胞異常增殖和凋亡失衡。翼狀胬肉的發病可能代表著細胞增生和凋亡的異常。
目前，已發現的凋亡相關基因多達數十種，根據其功能的不同可分為三類：抑制凋亡基因，如Bcl-2、EIB等；促進凋亡基因，如p53、Bax、Fas等，雙向調控基因；如c-myc、Bclx等。
p53 基因參與細胞DNA的修復與合成，調節細胞的分化、凋亡，控制細胞的周期，是引起人類腫瘤發生最常見的突變基因。翼狀胬肉的發生、發展與許多環境因素相關，如紫外線刺激、慢性充血和炎癥等。其中，紫外線是最重要的環境致病因素，戶外工作者(接受紫外線輻射較多) 的p53蛋白表達較戶內工作者明顯增多，提示紫外線可能引起p53蛋白的異常表達［4］。
p53作為抑癌基因，主要的生物學作用是調控細胞周期和誘導細胞凋亡，維持基因組和細胞穩定，抑制腫瘤生長。p53基因定位于17P13.1，長度約20kb，由11個外顯子和10個內含子組成，人p53蛋白由393個氨基酸組成，分子量為53×103。p53分為野生型和突變型，野生型為腫瘤抑制基因，可抑制在培養過程中有其他癌基因作用的細胞的轉化和生長。而當p53基因發生丟失或突變時，改變原有的功能引起細胞生長的失控及轉錄即為突變型p53。突變型p53基因不僅引起p53抑癌活性的喪失，而且具有促進惡性轉化的活性。野生型p53其蛋白產物半衰期較短，免疫組化法難以檢測，p53基因突變可使該蛋白失活，在組織中堆積，通過免疫組化方法可以檢測到。
細胞增殖活躍是翼狀胬肉生長和復發的重要基礎。具有增殖活性的變性結膜上皮細胞侵入角膜，在多種細胞因子作用下，增生的球結膜進展性肥厚，成纖維細胞增殖和新生血管產生。本實驗中翼狀胬肉組織HE染色上皮層均可見不同程度的增生，最厚者可達20余層。上皮下組織可見成纖維細胞增生活躍、新生血管增多。本實驗結果發現翼狀胬肉組織p53蛋白表達較正常結膜增多(P<0.01)，陽性表達呈細胞核型。我們推測翼狀胬肉病變發展的早期可能存在著p53基因的突變，從而使正常p53腫瘤抑制基因作用喪失，導致結膜組織過度增殖及胬肉纖維血管組織向角膜侵襲。
【參考文獻】
［1］徐錦堂，孫秉基，方海州.眼表疾病的基礎理論和臨床［M］.天津：天津科學技術出版社，2002:287.
［2］喻謙,柳林. 翼狀胬肉發病機制研究進展［J］.眼科研究,2008,26(9):713-716.
［3］姚艷嬌，劉新.翼狀胬肉的治療進展［J］.國際眼科雜志，2008，8（9）：1898-1901.
［4］張梅,劉祖國,李永平,等.翼狀胬肉上皮細胞p53 蛋白的表達及其功能狀態的研究［J］.中華眼科雜志,2002,38(2):115-117.
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