器官模擬物的三維培養(yǎng)技術(shù)解析論文

　　【提要】 類器官是成熟器官來源的三維上皮結(jié)構(gòu)，包含干細胞或祖細胞，能夠獨立擴增并且分化為器官特異性上皮。利用三維方法培養(yǎng)類器官技術(shù)在組織再生、研究機體生理病理學(xué)、構(gòu)建疾病模型及藥物篩選等方面均有廣闊的前景應(yīng)用。本文將就三維條件下類器官培養(yǎng)的基礎(chǔ)、應(yīng)用和前景作一簡要綜述。

　　【關(guān)鍵詞】 類器官； 三維培養(yǎng)； 再生醫(yī)學(xué)； 綜述。

　　類器官是指在結(jié)構(gòu)和功能上都類似來源器官或組織的模擬物，其為成熟器官來源的三維上皮結(jié)構(gòu)，包含干細胞或祖細胞，能夠獨立擴增并且分化為器官特異性上皮。Lancaster 等[1]認為類器官是源于多能干細胞或器官祖細胞且具有胚層特異性的類器官體，其包含目標(biāo)器官中至少一種細胞類型，能夠自組裝為器官樣結(jié)構(gòu)并具有其生理結(jié)構(gòu)和功能特征。通過 3D 培養(yǎng)技術(shù)在體外利用干細胞或類器官模擬人類器官組織的生理發(fā)育過程和誘導(dǎo)致病，并應(yīng)用于生物醫(yī)藥和再生醫(yī)學(xué)，已成為目前組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的新熱點。本文就類器官培養(yǎng)的基礎(chǔ)、應(yīng)用和前景做一綜述。

　　1 類器官技術(shù)簡介

　　1. 1 類器官形成的基礎(chǔ)

　　自組裝是類器官形成的關(guān)鍵，其是指在無外力干預(yù)的條件下，干細胞或多細胞依靠各組分間的相互作用自我分化為多種結(jié)構(gòu)的過程，例如在唾液腺上皮細胞的三維培養(yǎng)中可見自發(fā)形成的分支樣或者芽狀結(jié)構(gòu)[2].這一過程的自發(fā)形成依賴于生理性的內(nèi)源機制，并由細胞與基質(zhì)間以及細胞與細胞間的多種細胞因子及信號通路共同參與。但這一內(nèi)源機制并非固定不變，時間、空間的變化均可增加其復(fù)雜性和多樣性。在類器官形成過程中，關(guān)于自組裝的相關(guān)調(diào)控機制等問題，仍需要進一步深入研究。

　　1. 2 生物工程輔助技術(shù)類器官

　　類器官自組裝的實現(xiàn)很大程度上依賴于三維細胞培養(yǎng)體系的建立。根據(jù)是否為細胞提供支架材料，三維培養(yǎng)體系大體可分為基于支架的培養(yǎng)體系和無支架的培養(yǎng)體系，而支架又分為天然形成和人工合成支架。研究者們發(fā)現(xiàn)，生物支架是組織再生的關(guān)鍵因素，多種組織細胞可以在生物材料上生長、分化并最終形成人工組織或器官[3]

　　.生物支架對組織再生的這一作用與支架的組成成分、空間結(jié)構(gòu)、機械及化學(xué)特性、釋放生物化學(xué)信號及分子信號等性質(zhì)密不可分。而組織特異性細胞外基質(zhì)（ extracellular matrix,ECM） 在上述作用方面有獨特優(yōu)勢。有學(xué)者通過誘導(dǎo)胚胎干細胞獲得胰腺祖細胞系，將后者與不同發(fā)育時期的胰腺間充質(zhì)（ 間質(zhì)組織、間葉組織） 共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與器官類型匹配的間充質(zhì)可以使祖細胞擴增一百萬倍以上，并且在擴增、自我更新的同時保持不分化狀態(tài)，但同時仍保留其分化能力，因此，該學(xué)者認為 ECM 能夠傳遞階段特異性和組織特異性的再生信號[4],但具體機制尚需要進一步的研究。器官存在的微環(huán)境還通過隨時間和空間而變化的生物化學(xué)信號影響器官再生，所以需要在這方面進一步發(fā)展生物工程輔助技術(shù)[5].目前，有學(xué)者在仿生的聚乙二醇水凝膠上合成了一種特殊蛋白質(zhì)，而且其蛋白梯度可以人工控制，因而實現(xiàn)分子信號和化學(xué)信號在時間和空間上更為精確的釋放； 但這種蛋白梯度是靜態(tài)的，且只局限于凝膠表面的二維體系[5].2014 年，加拿大多倫多大學(xué)的研究員報道了一種新型數(shù)字化微流體平臺，該平臺可在水凝膠材料中培養(yǎng)細胞，然后用電場操縱細胞，使得每個凝膠均可單獨訪問，動態(tài)流體交換更加溫和，成本明顯減少，并且可實現(xiàn)信號分子的三維調(diào)控； 此外，該研究員提出或許可以收集患者的小組織樣本并將其分布到數(shù)字微流體裝置的 3D 凝膠中，進行篩選藥物以確定個性醫(yī)療方案，而這將是實現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療理念的重要工具[6]

　　2 類器官的應(yīng)用

　　2. 1 腸類器官 HansClever

　　課題組證實單一的 Lgr5+干細胞能夠在體外持續(xù)增殖并自組裝形成隱窩 - 絨毛樣的小腸上皮結(jié)構(gòu)[7].進一步的研究結(jié)果顯示，單個成人 Lgr5+干細胞也能在體外成功擴增成結(jié)腸類器官，將這種功能性的結(jié)腸上皮移植到硫酸葡聚糖誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎小鼠模型中可以修復(fù)其受損的結(jié)腸上皮[8].這提示利用單一成人結(jié)腸干細胞體外擴增進行結(jié)腸干細胞治療是可行的[8].有學(xué)者還應(yīng)用人誘導(dǎo)型多能干細胞（ induced pluripotent stem cells,iPSCs） 直接定向分化為小腸組織的方法明確了 Wnt3a 蛋白和成纖維細胞生長因子 4 是后腸特定分化所必需的物質(zhì)，而且，這種iPSCs體外構(gòu)建的人體腸道組織中存在的小腸干細胞，也具有小腸特有的吸收和分泌功能[9].這有助于未來人腸道疾病藥物的設(shè)計研究，可大大提高了藥物利用率。目前，已有學(xué)者構(gòu)建了小鼠小腸 3D 類器官來進行 P-糖蛋白抑制劑的篩選，為 P-糖蛋白介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運研究提供了強有力的工具[10].

　　2. 2 肝類器官

　　2013 年，Takebe 等[11]將人多能干細胞來源的肝細胞、人間充質(zhì)干細胞和人內(nèi)皮細胞混合后在基質(zhì)膠中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn) 3 種細胞自組裝成 3D 化肝芽，將該肝芽移植到丙氧鳥苷誘導(dǎo)肝臟衰亡的 TKNOG 小鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)這種肝芽可以連接小鼠腸系膜血管，小鼠也出現(xiàn)了人類特有的藥物代謝過程。這為肝臟器官發(fā)生的研究提供了有益嘗試。大型哺乳動物的類器官再造工程也許能加速人類器官移植治療和疾病致病機制研究的進展。2015 年，Nantasanti 等[12]利用狗的肝臟干細胞構(gòu)建了可分化為功能性肝細胞的肝類器官模型，能用于銅潴留癥的治療。貓被認為是非常適用于研究人類代謝性疾病的模型，所以利用貓的膽道組織構(gòu)建肝類器官，可能是原發(fā)性肝膽疾病研究及藥物篩選的有益工具，但至今也未見利用貓建立長期保持基因穩(wěn)定的肝臟干/祖細胞培養(yǎng)體系的報道[13].

　　2. 3 胰腺類器官

　　有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)控制骨形態(tài)發(fā)生蛋白 4、堿性成纖維細胞生長因子、激活素 A 和 Wnt3a 的表達水平或使用一些小分子化合物進行干預(yù)時，可以控制內(nèi)胚層細胞向特定的方向分化，最終形成胰腺[14].目前，構(gòu)建胰島類器官的主要方法包括利用各種干祖細胞產(chǎn)生胰島樣細胞群和利用各種來源的胰腺細胞懸液或胰腺組織塊自組裝成擬胰島體[15].2011 年，Saito 等[16]將人 iPSCs 和胚胎小鼠胰島細胞體外共培養(yǎng)，最后形成能夠產(chǎn)生胰島素的不成熟細胞群，該細胞群由胰島 α 細胞包繞中央的 β 細胞構(gòu)成，這種結(jié)構(gòu)和成年鼠胰島相似，將其移植到鏈脲菌素誘導(dǎo)的高血糖小鼠模型中后發(fā)現(xiàn)小鼠血糖水平得到極大改善。而進一步的體內(nèi)實驗研究還需要關(guān)注如何規(guī)避免疫反應(yīng)、促進再血管化、促進類器官分化發(fā)育等問題，在這方面，Sabek 等[17]提出制備納米腺體來促進胰島發(fā)揮作用，這種納米腺體是運用 3D 打印技術(shù)制作可吸收聚合物膠囊包裹胰島樣細胞團形成的，這可能是未來胰島類器官應(yīng)用的一種思路。

　　2. 4 腦類器官

　　近來，譜系重編程技術(shù)為獲取特異性種子細胞提供了新的途徑。Lancaster 等[18]通過加入不同生長因子的方法將人類胚胎干細胞（ embryonic stemcell,ESC） 和 iPSC 在神經(jīng)培養(yǎng)基 3D 培養(yǎng)出了與 9 ~ 10周胚胎大腦類似的“類大腦”,此類迷你大腦具備人類大腦發(fā)育初期的一些主要區(qū)域，也出現(xiàn)了背側(cè)皮層、腹側(cè)前腦等可辨認的特征，但由于缺乏一些特定的特征，如小腦、海馬狀突起等，這些區(qū)域無法應(yīng)用于干細胞模型。之后，該研究者利用小顱畸形患者的皮膚成纖維細胞誘導(dǎo)形成了患者特異性 iPSC 細胞系，并應(yīng)用后者構(gòu)建了小顱畸形腦類器官模型，通過對照實驗發(fā)現(xiàn)，正常 ESC和該 iPSCs 在類器官形成上并沒有明顯差異，但是后者形成的類器官中有大量未成熟的神經(jīng)元分化[18],這為大腦發(fā)育紊亂類疾病的`研究提供了一定的思路。2015年 Kirwan 等[19]應(yīng)用人 iPSC 體外構(gòu)建了人大腦皮層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，能夠模擬人體內(nèi)皮層網(wǎng)絡(luò)的發(fā)育和功能，這表明可以在體外通過構(gòu)建大腦類器官來進行人類前腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)生理學(xué)機制的研究。

　　2. 5 前列腺類器官

　　2014 年，研究人員首次在實驗室利用來自轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者的活檢標(biāo)本和去勢抵抗性前列腺癌（ castration-resistant prostate cancer,CRPC） 患者的循環(huán)腫瘤細胞成功培育出 7 個前列腺癌類器官，這些前列腺癌類器官以及從中獲得的腫瘤移植物的組織結(jié)構(gòu)及基因突變譜與患者轉(zhuǎn)移灶樣本高度相似[20]。 Nicholson 等[21]也應(yīng)用類器官培養(yǎng)技術(shù)成功在體外構(gòu)建患者來源的異種移植物模型，相比于人源性腫瘤組織異種移植及基因工程鼠模型，這種新型的患者來源的類器官能更好地代表 CRPC 等高級別前列腺癌，還能代表前列腺癌的龐大臨床疾病譜，而這種疾病譜是目前僅有的前列腺癌細胞系無法代表的，因而在前列腺癌藥物篩選和個體化治療中展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。

　　3 展 望

　　類器官不僅是研究組織及器官發(fā)生、發(fā)展的有效工具，還能用于藥物療效和藥物毒理學(xué)性質(zhì)的檢測，更重要的是可以利用患者來源的干細胞深入研究疾病的發(fā)生機制、進行細胞及基因治療，這使得類器官有望成為今后的研究熱點。

　　3. 1 人體芯片

　　人體芯片或器官芯片與類器官的構(gòu)建原理相似，是類器官在藥物毒理及代謝方面的另一種應(yīng)。用形式。器官芯片是將活的人體器官細胞植入到高度模擬人體微環(huán)境的芯片上制備而成。單個器官芯片的制作技術(shù)添加了多孔型隔膜和營養(yǎng)液，使芯片能模仿人類的血液流動和細胞生長。目前已研制成功的器官芯片有“肺”、“肝”、“腎”和“腸”.2010 年，模擬人肺泡和毛細血管間作用的仿生生物系統(tǒng)構(gòu)建成功，這一人體肺器官芯片揭示機械應(yīng)力在塵肺發(fā)病中的促進作用[22].2013 年，有學(xué)者利用人類近端腎小管制備器官芯片來評估順鉑的腎毒性[23].2016 年，可替代的人工腎臟芯片被成功研發(fā)，將其植入腎病患者體內(nèi)后能使患者無需透析治療，臨床實驗前的各期人體實驗有望在 2017 年底啟動。近期，在美國波士頓召開的 2016 年器官芯片移動大會首次展出了人體內(nèi)臟芯片系統(tǒng)，這一系統(tǒng)連接了7 個主要的器官芯片，高度模擬人體生理機能。不可否認，器官芯片能高度模擬人體狀態(tài)，從而在制藥領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大應(yīng)用前景，很有可能替代動物實驗，大大減少藥物研制的成本和進行臨床前人體實驗的時間，同時能更加了解新藥的毒性作用和人體對藥物的代謝反應(yīng)。但是也有學(xué)者提出，器官芯片只能植入單一類型的器官細胞，而人們利用動物進行藥物測試的一大原因是可以觀察到藥物對整個生命系統(tǒng)的作用，包括內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，各種器官之間的相互作用也是其中一個重要觀察內(nèi)容，因而是否能夠利用器官芯片組合成人體芯片進行實驗將是未來的一個值得研究的內(nèi)容[24].因此，這種新型實驗芯片能否真正取代動物實驗，還有待驗證。

　　3. 2 臨床治療

　　在利用自體干祖細胞構(gòu)建生物人工器官并應(yīng)用于移植治療方面，類器官具有巨大潛力。此外，利用正常人體和患者來源的組織培養(yǎng)獲得的類器官能夠用于相應(yīng)組織的生理學(xué)和病理學(xué)研究，正常腎臟類器官培養(yǎng)可能有助于明確 Wnt 信號通路的作用，眾所周知這一信號通路在腎臟生理性發(fā)育中發(fā)揮重要作用，但其具體作用機制卻并不明確[25 -26].目前，最新的研究是利用確診某種疾病患者的組織細胞分化培養(yǎng)為類器官，并進行藥物篩選以實現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療[27].已經(jīng)有學(xué)者用大腸癌患者的腫瘤細胞分化形成的類器官建立了一個類器官生物銀行，利用類器官來檢測人體對藥物的敏感性和耐藥性，從而將患者的腫瘤類型和藥物進行配對，最大限度地發(fā)揮藥物效用并減少不良反應(yīng)[28].

　　4 缺點及發(fā)展瓶頸

　　目前，雖然類器官在體外實驗中表現(xiàn)出自我更新和分化的能力，但是傳代次數(shù)有限，如何提高其傳代能力并確保在患者體內(nèi)也能保持增殖和未分化狀態(tài)是一個重大挑戰(zhàn)[29].另外，體外培養(yǎng)組織一直存在無法再現(xiàn)生物體內(nèi)血管網(wǎng)絡(luò)從而造成營養(yǎng)代謝障礙的問題，如果再生醫(yī)學(xué)的研究者試圖在大型動物上利用類器官培養(yǎng)得到可用于人體器官移植的替代物，那么就需要進一步研究實現(xiàn)血管化的方法。最后，雖然精準(zhǔn)醫(yī)療中類器官能夠模擬腫瘤的關(guān)鍵成分，但是還是有一些重要元素是類器官無法包含的。如何提高其成熟度，使目前低級的類器官向更高級轉(zhuǎn)化，從而更加接近致病狀態(tài)，如免疫系統(tǒng)的引進，將是未來研究的一個方向。

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